植物細(xì)胞培養(yǎng)總被聚集體困擾？這對(duì)“監(jiān)測(cè)+表征”組合給出新解法
點(diǎn)擊次數(shù)：64 更新時(shí)間：2026-05-22
作為一種無(wú)菌、可控的生物技術(shù)，已成為大規(guī)模生產(chǎn)植物源代謝物的重要手段。從基礎(chǔ)研究（植物生長(zhǎng)和分化研究）到工業(yè)化生產(chǎn)（如抗癌藥物紫杉醇的生產(chǎn)），植物細(xì)胞培養(yǎng)已成為替代傳統(tǒng)方法的日益受到關(guān)注的成本效益型方案。然而，要實(shí)現(xiàn)高效的細(xì)胞增殖和產(chǎn)物積累，對(duì)培養(yǎng)條件的精確監(jiān)控至關(guān)重要。
但做植物細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)們，這些坑你一定踩過(guò)：
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取樣焦慮：為了測(cè)pH和生物量，不得不中斷搖瓶培養(yǎng)，細(xì)胞團(tuán)塊讓取樣更加困難。
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數(shù)據(jù)盲區(qū)：傳統(tǒng)離線(xiàn)檢測(cè)只能看到“快照”，錯(cuò)過(guò)關(guān)鍵代謝時(shí)間窗。
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細(xì)胞團(tuán)塊難題：植物細(xì)胞易形成聚集體，傳統(tǒng)方法難以準(zhǔn)確衡量細(xì)胞大小和聚集狀態(tài)。
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通量瓶頸：想優(yōu)化培養(yǎng)條件？48個(gè)條件要搖多少瓶子、熬多少個(gè)夜？
本文將介紹如何運(yùn)用BioLector XT微型生物反應(yīng)器和Multisizer 4e庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器，實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化和細(xì)胞生長(zhǎng)的精準(zhǔn)表征，讓工藝開(kāi)發(fā)周期從“按月算”變成“按天算”！
BioLector XT在線(xiàn)監(jiān)測(cè)更優(yōu)培養(yǎng)條件
BioLector XT是一款小型化、自動(dòng)化的微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量篩選、培養(yǎng)參數(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（如pH、生物量、溶氧飽和度、振蕩速度及熒光強(qiáng)度）以及補(bǔ)料策略?xún)?yōu)化。尤為重要的是，上述所有參數(shù)的監(jiān)測(cè)均可在不間斷振蕩、無(wú)需取樣的條件下在線(xiàn)完成。
本研究以表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的煙草BY-2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系（Nicotiana tabacum BY-2）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在BioLector XT的48孔微孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。
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預(yù)培養(yǎng)條件為：將20 mL培養(yǎng)7天的種子液接種至含180 mL新鮮培養(yǎng)基（pH 5.8）和100 mg硫酸卡那霉素的250 mL搖瓶中，于20 °C、190 rpm（振幅50 mm）條件下振蕩培養(yǎng)。
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培養(yǎng)基配方：4.4 g/L MSMO基礎(chǔ)鹽（含微量有機(jī)物）、0.2 g/L磷酸二氫鉀、0.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0.6 mg/L硫胺素及30 g/L碳源。主培養(yǎng)在BioLector XT中進(jìn)行，振蕩頻率1000 rpm（振幅3 mm），溫度26 °C。
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實(shí)驗(yàn)分為兩部分：實(shí)驗(yàn)1驗(yàn)證BioLector XT的監(jiān)測(cè)能力，對(duì)5個(gè)獨(dú)立孔進(jìn)行接種，接種量10%（v/v），在線(xiàn)監(jiān)測(cè)散射光（生物量）、GFP熒光、NAD（P）H熒光、pH及溶氧（DO）；實(shí)驗(yàn)2考察不同碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖，濃度均為30 g/L）和接種量（5%或10% v/v）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果如圖2所示。散射光信號(hào)估算的生物量呈現(xiàn)典型的指數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖2A）。約110小時(shí)處觀察到的信號(hào)下降并非由生物量降低引起，而是由于碳源耗盡后細(xì)胞形態(tài)由圓形變?yōu)樯扉L(zhǎng)形，導(dǎo)致散射光特性發(fā)生改變——這是植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的典型特征。與此一致，與生長(zhǎng)相關(guān)的GFP表達(dá)也呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)（圖2B）。NAD（P）H信號(hào)在細(xì)胞代謝穩(wěn)定期間與生物量濃度高度相關(guān)（圖2C）。
在線(xiàn)監(jiān)測(cè)同時(shí)顯示，pH在前24小時(shí)內(nèi)降至最低值5.0，隨后緩慢回升至最高值6.5（推測(cè)與培養(yǎng)基中氮化合物的代謝有關(guān)）（圖2D）；溶氧值則緩慢下降至最低約85%（圖2E）。所有五個(gè)孔在各參數(shù)上均表現(xiàn)出良好的一致性。
圖2：展示了植物細(xì)胞培養(yǎng)的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)可重復(fù)性數(shù)據(jù)，包括：(A) 散射光信號(hào)（生物量）；(B) GFP熒光信號(hào)；(C) NAD (P) H信號(hào)；(D) pH變化曲線(xiàn)；(E) 溶氧（DO）變化曲線(xiàn)。五個(gè)獨(dú)立孔的數(shù)據(jù)高度一致，證明了BioLector XT監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的可靠性與穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)2重點(diǎn)評(píng)估了碳源類(lèi)型和接種量對(duì)培養(yǎng)效果的影響，結(jié)果如圖3所示。令人意外的是，不同碳源類(lèi)型及接種量條件下，培養(yǎng)終點(diǎn)的生物量濃度（散射光或NAD (P) H信號(hào)）并無(wú)顯著差異（圖3A和圖3C）。但生長(zhǎng)速率存在明顯不同：以10%（v/v）蔗糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)速率最快，約100小時(shí)即達(dá)到最大生物量；而以5%（v/v）葡萄糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)最慢，達(dá)到最大生物量需約190小時(shí)。GFP熒光信號(hào)的變化趨勢(shì)與此一致（圖3B）。
圖3：展示了不同碳源和接種量對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)的影響：(A) 散射光信號(hào)（生物量）隨時(shí)間變化曲線(xiàn)；(B) GFP熒光信號(hào)曲線(xiàn)；(C) NAD (P) H信號(hào)曲線(xiàn)。結(jié)果表明，蔗糖作為碳源配合 10% 接種量可獲得最快的生長(zhǎng)速率，而各組最終生物量趨于一致。
這些結(jié)果表明，BioLector XT可有效用于優(yōu)化植物細(xì)胞培養(yǎng)條件。持續(xù)振蕩測(cè)量確保了良好的傳質(zhì)和細(xì)胞懸浮均一性；散射光測(cè)量適用于植物懸浮培養(yǎng)中的異質(zhì)性大細(xì)胞聚集體；系統(tǒng)支持單次運(yùn)行多達(dá)48個(gè)批次的高通量篩選，為培養(yǎng)條件評(píng)估、工藝開(kāi)發(fā)和規(guī)模放大提供了強(qiáng)有力的工具。
Multisizer 4e精準(zhǔn)表征細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)
細(xì)胞尺寸是洞察多種細(xì)胞機(jī)制的關(guān)鍵參數(shù)，包括細(xì)胞周期、滲透調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡、病原體侵染、吞噬作用及物種多樣性等。Multisizer 4e庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器基于庫(kù)爾特原理，可檢測(cè)200 nm至1,600 μm范圍內(nèi)的顆粒，不受顆粒性質(zhì)或光學(xué)特性的影響，是植物細(xì)胞尺寸和聚集體分析的理想工具。
待測(cè)樣品懸浮于0.9%電解質(zhì)溶液中，通過(guò)一個(gè)小孔管（aperture）被吸入。孔管兩側(cè)各有一個(gè)浸沒(méi)電極，形成恒定電流。當(dāng)每個(gè)顆粒通過(guò)孔管時(shí)，會(huì)瞬時(shí)置換與其自身體積相等的導(dǎo)電液體，導(dǎo)致孔管阻抗瞬時(shí)增加，產(chǎn)生一個(gè)與顆粒體積成正比的電壓脈沖。脈沖數(shù)量對(duì)應(yīng)顆粒數(shù)量，脈沖幅度對(duì)應(yīng)顆粒體積。該技術(shù)使研究人員能夠精確測(cè)定樣品的體積、數(shù)量和濃度，并實(shí)時(shí)檢測(cè)尺寸變化——這對(duì)檢測(cè)植物細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的細(xì)胞聚集體尤為重要。
取植物細(xì)胞培養(yǎng)樣品，以Isoton 2稀釋液按1:200預(yù)稀釋于400 mL燒杯中。從該稀釋液中取500 μL進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量采用1000 μm孔管，單次測(cè)量時(shí)間120秒。主要儀器設(shè)置參數(shù)見(jiàn)表1。所得數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)字脈沖處理（DPP）技術(shù)進(jìn)行分析，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)每個(gè)獨(dú)立脈沖的采集、存儲(chǔ)和顯示，支持在后續(xù)分析中對(duì)脈沖譜的特定區(qū)域進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估。
表1：Multisizer 4e實(shí)驗(yàn)設(shè)置參數(shù)
如圖4的DPP數(shù)據(jù)所示，該培養(yǎng)體系中植物細(xì)胞的尺寸分布在30至320 μm范圍內(nèi)。DPP技術(shù)以脈沖高度對(duì)脈沖寬度的散點(diǎn)圖形式呈現(xiàn)原始數(shù)據(jù)，圖中虛線(xiàn)標(biāo)注了用于進(jìn)一步分析的數(shù)據(jù)選取范圍。
圖4：展示了Multisizer 4e的數(shù)字脈沖處理（DPP）原始數(shù)據(jù)。以脈沖寬度對(duì)脈沖高度的散點(diǎn)圖形式呈現(xiàn)，虛線(xiàn)標(biāo)示了用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)篩選范圍。該技術(shù)提供了超高的分辨率，可檢測(cè)樣本中單個(gè)顆粒級(jí)別的變化。
從DPP原始數(shù)據(jù)中，研究人員可以選擇特定尺寸區(qū)間（如圖4虛線(xiàn)所示的范圍）并生成頻率分布直方圖。例如，圖5展示了選取40-140 μm尺寸區(qū)間后得到的細(xì)胞直徑分布直方圖，清晰呈現(xiàn)了細(xì)胞群體的尺寸分布特征。
圖5：展示了選取40-140 μm尺寸區(qū)間后得到的植物細(xì)胞直徑分布直方圖。該數(shù)據(jù)可用于研究細(xì)胞尺寸隨時(shí)間的變化規(guī)律，表征細(xì)胞聚集體的形成過(guò)程，以及比較不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞狀態(tài)。
這類(lèi)數(shù)據(jù)具有廣泛的分析應(yīng)用價(jià)值。例如，通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行比較分析，可研究細(xì)胞尺寸的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，幫助表征細(xì)胞聚集體的形成過(guò)程。此外，比較不同環(huán)境條件下獲得的細(xì)胞尺寸數(shù)據(jù)，有助于進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝。Multisizer 4e的DPP技術(shù)提供了超高分辨率與精度（可檢測(cè)1 mL樣品中的單個(gè)顆粒），這是其他技術(shù)難以企及的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
總結(jié)：聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)勢(shì)1+1>2
BioLector XT微型生物反應(yīng)器與Multisizer 4e庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器作為兩款臺(tái)式設(shè)備，憑借直觀的用戶(hù)界面，可輕松融入任何實(shí)驗(yàn)室工作流程，為植物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的優(yōu)化與監(jiān)測(cè)提供端到端的解決方案。
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| 48個(gè)碳源/接種條件并行測(cè)試，在線(xiàn)鎖定最優(yōu)參數(shù) | 快速評(píng)估細(xì)胞大小分布與團(tuán)聚狀態(tài) |
| 實(shí)時(shí)生物量、溶氧趨勢(shì)，預(yù)判代謝積累峰 | 取樣檢測(cè)細(xì)胞大小分布，解讀粘附與團(tuán)聚狀態(tài) |
| 數(shù)據(jù)直接用于生物反應(yīng)器放大模型 | 標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控，確保批次一致性 |
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通量：24或32孔FlowerPlate (R) 微孔板，工作體積0.8-2.4 mL
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監(jiān)測(cè)參數(shù)：生物量（光密度）、pH、溶氧（DO）、熒光強(qiáng)度（GFP/RFP等）、震蕩轉(zhuǎn)速
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微流控功能：支持pH精確控制與補(bǔ)料策略（Fed-Batch）
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軟件：直觀可視化界面，實(shí)時(shí)生成生長(zhǎng)曲線(xiàn)與產(chǎn)物表達(dá)動(dòng)力學(xué)
Multisizer 4e庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器
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檢測(cè)原理：庫(kù)爾特原理（電阻法），基于顆粒體積進(jìn)行計(jì)數(shù)和sizing
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孔徑選擇：20 μm-2,000 μm多種孔徑管，覆蓋細(xì)菌到大型細(xì)胞團(tuán)
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核心技術(shù)：Digital Pulse Processing（DPP），支持原始脈沖數(shù)據(jù)回溯分析
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分辨率：400個(gè)粒徑通道，可檢測(cè)1顆粒/mL的稀濃度樣品
植物細(xì)胞培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)的“快準(zhǔn)狠”時(shí)代已經(jīng)到來(lái)！無(wú)論是植物天然產(chǎn)物的高通量篩選，還是生物制藥的工藝表征，這套組合都能為你加速獲得答案。
