本文描述了在 HEK293 細胞系中，使用 貝克曼庫爾特（Beckman Coulter）Biomek i3 自動化工作站執(zhí)行脂質體瞬時轉染 DOE（Design of Experiments）的實驗流程與結果。
實驗重點在于通過自動化方式執(zhí)行細胞鋪板、轉染體系制備、時間控制加樣及混勻操作，以減少人為操作差異對 DOE 結果的影響。
轉染效果通過熒光顯微成像及 Beckman Coulter CytoFLEX 流式細胞分析儀進行評估。
實驗結論僅基于觀察數(shù)據(jù)，用于支持后續(xù)轉染條件優(yōu)化與工藝選擇。

一、研究背景

細胞瞬時轉染常用于基因表達分析、蛋白功能研究及相關生物學研究。在開展相關實驗之前，通常需要通過 DOE 的方式對轉染條件進行初步探索，包括 DNA 投加量與轉染試劑用量范圍等。

在 DOE 場景中，實驗涉及多種變量與重復條件。手工操作在體積控制、時間控制及跨孔一致性方面存在一定難度。

為降低操作差異對 DOE 結果的影響，本實驗采用 貝克曼庫爾特（Beckman Coulter）Biomek i3 桌面級自動化工作站執(zhí)行與轉染相關的液體處理操作。

二、實驗概述

1. 使用平臺與檢測方式

·       自動化平臺：Beckman Coulter Biomek i3

·       成像檢測：EVOS（明場與 GFP）

·       流式檢測：Beckman Coulter CytoFLEX 流式細胞分析儀

Biomek i3 用于執(zhí)行細胞鋪板、轉染體系制備、加樣和混勻等步驟，檢測環(huán)節(jié)獨立完成。

三、實驗中關注的主要問題

1. 實驗變量較多

本實驗中涉及的變量包括：

·       細胞鋪板密度

·       DNA 投加量

·       轉染試劑用量

·       預混與加樣的時間間隔

·       加樣位置與混勻方式

在 DOE 條件下，需要盡量減少非設計變量帶來的影響。

2. 轉染步驟中的時間控制

在脂質體轉染流程中，DNA 與轉染試劑混合后至加樣的時間間隔可能對結果產(chǎn)生影響。
因此，本實驗對該時間間隔進行統(tǒng)一控制，以提高不同條件之間的可比性。

四、實驗流程

1. 細胞鋪板

·       細胞系：HEK293

·       板型：96 孔平底黑壁透底板

·       接種密度： 

o       25,000 cells / 100 μL

o       50,000 cells / 100 μL

鋪板完成后，使用 i3X MiniMax 成像模塊對細胞沉降和狀態(tài)進行確認。

2. 轉染體系設置

根據(jù)試劑說明書，設置以下條件組合：

·       DNA：100 ng vs 400 ng / 孔

·       Lipofectamine：0.15 μL vs 0.3 μL / 孔

·       P3000：按說明書比例

·       稀釋體系：Opti-MEM

所有體系由 Biomek i3 按 DOE 布局制備。

圖1：Biomek i3 DOE板布局

3. 預混與加樣控制

·       各預混體系通過程序錯峰啟動

·       DNA/轉染試劑預混至加樣的時間統(tǒng)一為 12 分鐘

·       加樣位置為液面下約 1 mm

·       加樣后采用緩慢吹吸配合傾斜混勻

上述操作用于統(tǒng)一處理條件，不對轉染機制作額外假設。

4. 培養(yǎng)與檢測

·       培養(yǎng)條件：37?°C，5% CO?

·       成像：EVOS（明場與 GFP，參數(shù)保持一致）

·       流式分析：
使用 Beckman Coulter CytoFLEX，采用標準門控流程完成定量分析。

圖2：Biomek i3方法選項選擇器MOS，支持輕松訪問常用的DOE方法設置

五、實驗結果（基于觀察）

1.       在 400 ng DNA 條件下，部分條件中觀察到轉染信號下降的情況。
該結果與細胞毒性相關的已有認知一致，但本實驗未進一步探討機制。

2.       在 25,000 cells 接種密度條件下，0.15 μL 與 0.3 μL Lipofectamine 在轉染結果上未觀察到明顯差異。
該觀察結果為后續(xù)條件篩選提供參考。

圖3：在每孔細胞接種密度為25000個細胞的四種預混體系條件下的典型熒光顯微成像

圖4：代表性的流式細胞術門控策略，從左上角順時針：選擇細胞、選擇單線態(tài)細胞、將熒光門應用于陰性對照（僅限培養(yǎng)基）孔和將熒光門用于轉染細胞孔

六、關于 Biomek i3 在本實驗中的作用說明

在本實驗中，貝克曼庫爾特 Biomek i3主要用于：

·       執(zhí)行統(tǒng)一的液體處理操作

·       控制加樣體積與時間間隔

·       支持 DOE 條件的重復執(zhí)行

本實驗結果用于評價轉染條件本身，不用于比較自動化與手工操作在轉染效率上的差異。

FAQ

Q1：本實驗是否證明自動化可以提高轉染效率？

否。本實驗僅關注操作一致性對 DOE 數(shù)據(jù)可比性的影響，未比較效率高低。

Q2：Biomek i3 在實驗中解決了什么問題？

主要用于減少體積、時間和混勻方式上的人為差異。

Q3：是否必須搭配 CytoFLEX 使用？

不是。CytoFLEX 僅作為本實驗的定量檢測工具之一。

Q4：實驗結果是否可以直接外推到其他細胞系？

不可以。不同細胞系需單獨進行條件優(yōu)化。

參考文獻

應用說明《使用Biomek i3自動化工作站進行自動化細胞鋪板和基于脂質體的瞬時轉染實驗設計（DOE）》